Predição e caracterização de epítopos de proteínas hipotéticas e funcionais de leishmania spp. aplicados no diagnóstico sorológico das leishmanioses tegumentar e visceral

Abstract

As leishmanioses são um espectro de doenças, causadas por protozoários do gênero Leishmania, que se apresentam nas formas de Leishmaniose Tegumentar cutânea, muco-cutânea ou disseminada; e Leishmaniose Visceral dependendo da espécie do parasita. São um problema de saúde pública em 102 países do mundo, incluindo o Brasil. O controle epidemiológico da doença se faz necessário e o diagnóstico eficaz é uma das medidas profiláticas. No entanto os diagnósticos existentes apresentam limitações, principalmente no que diz respeito a reatividade cruzada com proteínas de outros parasitas. Assim, buscando novos antígenos que diminuam as reações cruzadas no sorodiagnóstico das Leishmanioses, este trabalho teve como objetivo predizer epítopos de linfócitos B e padronizar metodologia de análise in silico com a combinação de programas de bioinformática disponíveis na web. Para isto, foram analisadas 12 proteínas de Leishmania utilizando o programa Blast-p para avaliar a similaridade com outras proteínas presentes no gênero Leishmania e nt5o gênero Trypanosoma. Os dados foram exemplificados em duas destas proteínas: Proteína Hipotética de Leishmania infantum JPCM5 (XP_001468941.1) com similaridade entre 94% e 98% com proteínas de Leishmania e entre 71% e 74% com proteínas de Trypanosoma; Proteína Hipotética de Leishmania braziliensis MHOM/BR/75/M2904 (XP_001568689.1) a similaridade foi entre 92% e 99% com proteínas de Leishmania e entre 43% a 53% com proteínas de Trypanosoma. Os epítopos lineares preditos pelo programa ABCpred foram 8 para proteína hipotética de L. infantum com confiabilidade entre 95% a 86%; e 3 para proteína hipotética de L. braziliensis, com confiabilidade de 85%, 88% e 90%. Através do programa IEDB foram obtidos os aminoácidos acessíveis de cada sequência proteica e realizado a alinhamento com programa Clustal Ômega. A sobreposição dos resultados revelou os aminoácidos ideais para produção de epítopos conformacionais. Das 12 proteínas analisadas duas foram testadas, os epítopos sugeridos foram sintetizados e utilizados como antígeno de cobertura em teste ELISA. Para o peptídeo sintético de L. infantum foram testadas as reatividades de soros de cães positivos sintomáticos e positivos assintomáticos para Leishmaniose Visceral, negativos de área endêmica e negativos de área não endêmica, vacinados e portadores de outras doenças como doença de Chagas, Erlichiose e Babesiose. A curva ROC mostra sensibilidade muito próxima a 100% quando foi utilizado peptídeo sintético e de 97% para o antígeno total solúvel de L. infantum; com acurácia de 99% e 85% respectivamente. O peptídeo sintético de L. braziliensis foi testado frente a soros humanos de pacientes portadores da Leishmaniose Tegumentar cutânea e mucocutânea, pacientes negativos para leishmaniose e portadores de doença de Chagas. O teste ELISA com peptídeo sintético de L. braziliensis apresentou 100% de sensibilidade e de especificidade, com AUC de 100%. Utilizando o antígeno solúvel de L. braziliensis a sensibilidade do teste foi de 97% e a especificidade diminuiu para 66%, apresentando acurácia de 83%. Portanto, os resultados com os peptídeos sintetizados melhoram a acurácia do teste ELISA diminuindo as reações cruzadas, demsntrando que os procedimentos de bioinformática sugeridos neste trabalho são ferramentas eficazes na construção de epítopos que mimetizam um epítopo conformacional.